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棒曲霉素PAT作為天然新型PSII抑制劑的作用模式


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化學(xué)除草劑廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，但其對人體健康的危害日益受到人們的關(guān)注。此外，抗除草劑雜草的廣泛蔓延，降低了作物的質(zhì)量和產(chǎn)量。因此，尋找更廣泛的生物除草劑資源，且毒性低、結(jié)構(gòu)新穎、靶標(biāo)獨特、環(huán)境友好成為迫切需要研究的課題。

與傳統(tǒng)的化學(xué)除草劑防治相比，生物防治在雜草防治中發(fā)揮著重要作用。天然化合物的開發(fā)是生物除草劑開發(fā)的重要途徑之一。本研究旨在闡明棒曲霉素PAT的植物毒性，并揭示其作為一種新的天然光系統(tǒng)II (PSII)抑制劑的作用方式。

PAT對多種植物的毒性研究

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如上圖，62種植物中43種對PAT表現(xiàn)出良好的敏感性，特別是菊科和禾本科雜草。另外，PAT處理后8種植物，包括4種作物(O. sativa, T. aestivum, Morus alba,& G. barbadense)屬于葉片壞死損傷1~10 mm2的低感植物，因此PAT在雜草控制方面具有廣泛的用途，是一種具有開發(fā)潛力的生物除草劑，可用于防治玉米地的外來雜草和闊葉雜草。

液相氧電極分段式測定電子傳遞鏈活性定位PAT抑制PSII電子傳遞鏈位點

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如下圖，為了驗證PAT在植物光合系統(tǒng)中方的作用位點，根據(jù)Coombs等[1]報道的液相氧電極（Hansatech Instruments Ltd Oxygen Electrode Measurement Systems）分段式檢測方法，通過在葉綠體類囊體膜中添加人工電子供體和電子受體的方法，將電子傳遞鏈分為五個階段分別檢測其放氧活性。

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類囊體膜與不同濃度PAT孵化30min后，測定不同階段的放氧活性，如下圖A，其中表征由H2O至PSI的整體電子傳遞鏈活性的1階段(H2O → MV)、表征PSII活性（含DCMU敏感位點）的3階段(H2O → phenylenediamine)和表征PSII&PSI整體活性（除放氧復(fù)合體外）的5階段(DPC → MV)，此三階段處理的放氧速率均表現(xiàn)出濃度依賴性的顯著下降。

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而表征PSI活性（不含DCMU敏感位點）的2階段和表征PSII活性（不含DCMU敏感位點）的4階段處理未發(fā)生顯著性變化。
以上結(jié)果表明PAT抑制了PSII的電子傳遞，導(dǎo)致整個電子傳遞活性降低。此外，PAT不影響PSI和PSII供體側(cè)的電子轉(zhuǎn)移活性。說明PAT的作用位點剛好在PSII受體側(cè)，與除草劑DCMU的作用位點相似。

熒光上升動力學(xué)OJIP曲線的分析

為了進一步準(zhǔn)確地探測PAT對PSII的作用位點，作者測定了PAT和DCMU處理的紫莖澤蘭葉片的熒光上升OJIP曲線。

如下圖，100μM DCMU處理出現(xiàn)了典型的J階躍升，熒光值在J-step快速達到與Fm相同的水平。J階的躍升是由于PSII反應(yīng)中心QA-的大量積而導(dǎo)致QA后的電子傳遞受阻導(dǎo)致[2,3]。

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PAT處理的最大熒光值Fm明顯降低，I-和P-相隨之處理濃度和時間的增加逐漸消失。這一現(xiàn)象與Gliotoxin處理相似，J階的躍升和Fm值的下降，表明gliotoxin不僅阻斷了QA后的電子傳遞，且對PSII天線色素的功能和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了破壞[4]。此外，β-Lactone處理樣品出現(xiàn)Fm的明顯下降是由于它抑制了P680至QA的電子傳遞[5]。

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如上圖為了研究PAT對熒光上升動力學(xué)性質(zhì)的詳細內(nèi)在影響，對每條OJIP曲線Fo~Fm進行雙重標(biāo)準(zhǔn)化得到可變熒光Vt = (Ft−Fo)/(Fm−Fo) （上圖C上部）和相對可變熒光ΔVt = Vt(treated)− Vt(control)。

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上圖C可見，與DCMU處理類似，PAT對熒光上升動力學(xué)的主要影響是J峰的顯著增加。此外如圖D，PAT略微降低了K-step。已知K-step的出現(xiàn)與放氧復(fù)合體（OEC）的活性有關(guān)，K-step或ΔK峰振幅的增加反映了OEC損傷的程度[2,6,7]。在這里，PAT對K-step的振幅有負面影響(上圖D)，且導(dǎo)致OEC中心的活性分數(shù)略有增加(下圖D)。表明PAT對OEC的活性有輕微的刺激作用。

JIP-test分析

JIP-test是分析熒光上升動力學(xué)OJIP曲線的有力工具，可以量化PSII在不同脅迫下的行為[2]。

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增加PAT濃度對Fo幾乎沒有影響，但顯著降低Fm值。暗適應(yīng)葉片Fo值代表葉綠素天線色素的性能[8]。Fm的下降可能是由于PQ庫的氧化或PSII天線色素結(jié)構(gòu)和功能的破壞導(dǎo)致[9]。
VJ的快速增加表明PAT阻斷了QA之后的PSII電子傳遞。同時φEo和ψEo的顯著降低也證實了這一點。φEo是PSII電子傳遞的量子產(chǎn)率，而ψEo則反應(yīng)了捕獲光子后電子傳遞至QA后電子傳遞鏈中的概率[2]。
 φPo（同F(xiàn)v/Fm）也發(fā)生顯著性下降，表明PAT處理同時也抑制了PSII原初光化學(xué)反應(yīng)的最大量子效率。

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如上圖D，由于PAT中斷了QA至QB的PSII電子流，預(yù)計會發(fā)生PSII反應(yīng)中心失活事件。QA- reducing centers的快速下降表明PAT確實導(dǎo)致了PSII反應(yīng)中心的快速關(guān)閉。QA還原中心的明顯減少必然導(dǎo)致非QA還原中心的增加，這些非QA還原中心也稱為熱沉中心(heat sink centers)，導(dǎo)致ROS的生成[2,10]。
熒光參數(shù)RJ表示QB位點被PSII抑制劑分子填充的PSII反應(yīng)中心的數(shù)量[2,11]。PAT結(jié)合QB位點的PSII反應(yīng)中心數(shù)量呈近似濃度依賴性的增加，因此，作者認為PAT引起的PSII反應(yīng)中心失活可能是PAT與D1蛋白結(jié)合的結(jié)果。

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見上圖，不同濃度PAT處理與ABS/CSm或TRo/CSm之間存在線性關(guān)系，這說明Fm的降低主要是由于ABS/ CSm或TRo/CSm值的降低。表明PAT不僅降低了葉綠素的濃度，而且破壞了天線色素組件的構(gòu)象，降低了天線色素分子之間以及從這些分子到PSII反應(yīng)中心的光能轉(zhuǎn)移效率。這可能是由于PSII結(jié)構(gòu)的氧化損傷產(chǎn)生ROS。

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PIABS作為對各種脅迫最敏感的JIP-test參數(shù)，表達了PSII的總體光合活性。葉片暴露于PAT后，PIABS表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性下降。此外，不同濃度PAT存在時，PIABS與φEo或 QA- reducing centers之間存在高度的線性相關(guān)關(guān)系(上圖)。這表明PAT引起的PSII電子傳遞受阻導(dǎo)致QA還原中心失活是PSII整體光合活性喪失的主要主導(dǎo)因素。
綜上所述，PAT主要靶向D1蛋白的QB位點，在受體側(cè)阻斷PSII電子傳遞。
PAT與D1蛋白互作建模

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PAT結(jié)合QB位點的分子相互作用模型表明，D1蛋白中的His252殘基通過形成氫鍵為PAT的O2羰基氧原子提供了一個關(guān)鍵配體。這不同于經(jīng)典的PSII除草劑和天然的PSII抑制劑。
因此，PAT是一種新型的天然光合抑制劑，可以設(shè)計和組裝具有更強除草劑活性的衍生物，具有開發(fā)成生物除草劑或作為模板支架發(fā)現(xiàn)具有更強除草劑活性的新衍生物的潛力。但PAT的準(zhǔn)確結(jié)合環(huán)境還需通過晶體學(xué)數(shù)據(jù)和突變體實驗進一步驗證。

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