藍(lán)細(xì)菌的α-和β-羧酶體含有由八個(gè)大亞基(RbcL)和八個(gè)小亞基(RbcS)組成的Rubisco以及碳酸酐酶復(fù)合物。由于HCO₃^-可以通過擴(kuò)散進(jìn)入羧酶體外殼而CO₂不能，碳酸酐酶復(fù)合物因此可以產(chǎn)生高濃度的CO₂用于Rubisco的碳固定。羧酶體外殼還一個(gè)作用是防止還原劑進(jìn)入，產(chǎn)生并保持氧化環(huán)境。β-羧酶體的形成涉及由CcmM蛋白介導(dǎo)的Rubisco聚集。

CcmM蛋白以兩種形式存在：其一為M58，發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞聚球藍(lán)細(xì)菌中全長的CcmM，N端包含有碳酸酐酶樣(carbonicanhydrase-like，CA)結(jié)構(gòu)域，隨后是三個(gè)通過柔性linker連接Rubisco小亞基樣(Rubisco small subunit-like，SSUL)模塊；另一種為M35缺乏碳酸酐酶樣(CA)結(jié)構(gòu)域(圖2g)。長期以來，人們推測SSUL模塊通過替換RbcS與Rubisco相互作用。但是，真實(shí)的情況和具體的分子機(jī)制并不清楚。

近期，德國馬普生化所Manajit Hayer-Hartl課題組在Nature雜志在線發(fā)表了題為Rubiscocondensate formation by CcmM in β-carboxysome biogenesis的研究論文，報(bào)導(dǎo)了Rubisco-CcmM復(fù)合物結(jié)構(gòu)，并且通過生理實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Rubisco在β-羧酶體生物發(fā)生過程中由CcmM介導(dǎo)的相變過程的分子機(jī)制。

此前有文章報(bào)道細(xì)胞通過一些使酶區(qū)域化的機(jī)制，作為調(diào)節(jié)代謝途徑和提高其效率的策略。近期研究的熱點(diǎn)相變是這個(gè)區(qū)域化作用的一種突出體現(xiàn)。

在這篇文章中，Hayer-Hartl課題組的研究人員不僅重組了Rubisco-CcmM復(fù)合物，解析了它的結(jié)構(gòu)，還觀測到了Rubisco相變過程對于酶活的重要性。了解羧酶體的生物發(fā)生對于未來將二氧化碳濃縮機(jī)制引入植物中具有重要意義。此前的推測是SSUL模塊通過替換RbcS與Rubisco相互作用，而從解析的Rubisco-CcmM復(fù)合物結(jié)構(gòu)來看，SSUL模塊結(jié)合在RbcL二聚體之間靠近Rubisco的“赤道”區(qū)域，連接Rubisco分子并誘導(dǎo)相分離成液體狀基質(zhì)。

他們首先解析了藍(lán)細(xì)菌中CcmM的SSUL1的晶體結(jié)構(gòu)(圖1a)，SSUL1與此前報(bào)導(dǎo)的RbcS結(jié)構(gòu)同源，但是序列不同源(圖1b)。并且，此結(jié)構(gòu)是氧化狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，可以看到Cys261和Cys279之間的二硫鍵。同時(shí)，他們也解析了還原狀態(tài)下的SSUL1結(jié)構(gòu)，除了沒有二硫鍵，其他與氧化狀態(tài)下一致。

圖1. SSUL1的氧化狀態(tài)晶體結(jié)構(gòu)和M35介導(dǎo)的與Rubisco形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。a：Se7924中CcmMD的氧化態(tài)SSUL1(旋轉(zhuǎn)90°雙視圖)；b：SSUL1(洋紅)與Se6301的RbcS(綠色)形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

通過生化實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)Rubisco和M35按一定比例混合會變渾濁，形成聚集網(wǎng)絡(luò)，并且驗(yàn)證該復(fù)合物是有功能的。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，不管是單獨(dú)的SSUL，還是M13-1，M13-2或M13-3(圖2g)，都不能形成該網(wǎng)絡(luò)。只有M24-1/2(SSUL1 and SSUL2)組合才能介導(dǎo)Rubisco網(wǎng)絡(luò)形成(圖2h,i)。

圖2. M58和M35的結(jié)構(gòu)域截短組合和Rubisco-M35的結(jié)合&解離生化實(shí)驗(yàn)

接著他們發(fā)現(xiàn)Rubisco-M35的網(wǎng)絡(luò)動態(tài)特性表明這些蛋白質(zhì)經(jīng)歷了液-液相分離(Liquid–liquidphase separation, LLPS)。通過熒光實(shí)驗(yàn)，將Rubisco和M35red按一定比例組合，可誘導(dǎo)分層成圓形熒光冷凝物，平均Feret直徑為約1.3μm，符合液滴的特征，確定是LLPS。與Rubisco在綠藻類淀粉核(pyrenoid)中的行為類似，在更具活力的氧化條件下，M35可將Rubisco濃縮成液體基質(zhì)，與羧酶體中的狀態(tài)一致。

圖3. Rubisco凝結(jié)成具有液體特性的網(wǎng)絡(luò)

研究發(fā)現(xiàn)，在晶體結(jié)構(gòu)中看到的SSUL中的二硫鍵對于羧酶體的生物學(xué)功能很重要，它增加了基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的靈活性，并且是體內(nèi)羧基體功能所必需的。

通過使用Cholorolab2+液相氧電極(英國，Hansatech)，評估野生型和突變型Se7942菌株對無機(jī)碳(Ci)的光合親和力差異，評估其在Ci濃度范圍內(nèi)的O₂釋放速率。突變掉相關(guān)的Cys，將SSUL1或SSUL2中二硫鍵的破壞，會導(dǎo)致羧酶體對CO₂的需求量增加約10至20倍，倍增的時(shí)間增加約2至2.5倍(圖4)。

圖4.二硫鍵在SSUL中的羧基功能作用。野生型Se7942和CcmM突變株對外部Ci的光合作用釋放O₂速率響應(yīng)。使用經(jīng)典Clark型氧電極(Cholorolab2+，Hansatech)，通過從10μm到250mm Ci測定不同菌株Se7942對Ci依賴性放氧速率。半胱氨酸突變體(C279S、C395S和CcmM-4s)具有中等的需要CO₂表型，而其中CcmM-4s具有最高的二氧化碳需求量。

為了解M35-Rubisco相互作用的分子基礎(chǔ)，他們通過cryo-EM和單粒子分析解析到了復(fù)合物結(jié)構(gòu)，在Rubisco“赤道”附近發(fā)現(xiàn)了額外的電子密度，通過結(jié)構(gòu)修正，解析了完整的Rubisco–SSUL復(fù)合物結(jié)構(gòu)(圖5)。

結(jié)構(gòu)顯示4個(gè)SSUL模塊結(jié)合一個(gè)Rubisco，與RbcL二聚體和RbcS之間的界面通過鹽橋、范德華力等作用力互作。同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)SSUL與RbcS的互作對此前發(fā)現(xiàn)的Rubisco網(wǎng)絡(luò)的形成非常重要。

圖5. M35-Rubisco的Cryo-EM結(jié)構(gòu)

因此，Rubisco的液體狀縮合物的形成是通過與SSUL結(jié)構(gòu)域的動態(tài)相互作用介導(dǎo)的，而不是通過低復(fù)雜性序列介導(dǎo)的，這與其它文獻(xiàn)中的報(bào)道結(jié)果是一致的。